Cum permite optogenetica selectarea neuronilor cu lumină și ce promitea pentru Parkinson în 2017

Jean Delbeke, Luis Hoffman, Katrien Mols, Dries Braeken și Dimiter Prodanov au examinat rezultatele experimentale, transferul genetic și implanturile necesare acestei intervenții, potrivit analizei publicate în Frontiers in Neuroscience, disponibilă pe Frontiers. Lucrarea sintetiza cercetări existente, optogenetica fiind folosită atunci predominant în experimente pe animale. O terapie optogenetică pentru retinita pigmentară primise statut de medicament orfan, iar studiile clinice inițiale îi evaluau siguranța.

Lumina controlează celulele care au primit proteine fotosensibile

Metoda pornește de la introducerea în celulele vizate a unei gene care le determină să producă proteine sensibile la lumină, numite opsine. Aceste proteine pot funcționa ca niște canale sau pompe pentru ionii care influențează activitatea electrică a celulei. Iluminarea lor poate activa ori inhiba neuronii, în funcție de proteina aleasă.

Cercetările asupra algelor sensibile la lumină, publicate de Nagel și colaboratorii în 2002, au contribuit la dezvoltarea acestei tehnologii. Ulterior au fost realizate variante de proteine care răspund la culori diferite și au viteze diferite de reacție.

Un exemplu studiat este canalrodopsina 2, abreviată ChR2. Lumina albastră schimbă forma proteinei și deschide un canal prin care intră ioni pozitivi. Dacă modificarea electrică a membranei atinge pragul necesar, neuronul generează un impuls. Oprirea luminii permite închiderea canalului.

Alte proteine fotosensibile pot reduce activitatea celulei. Combinarea unor opsine cu sensibilități diferite oferă posibilitatea activării și inhibării prin culori distincte. Controlul se poate extinde și la alte celule ale sistemului nervos, precum astrocitele, sau la procesele prin care celulele comunică între ele.

Autorii descriau șase componente necesare pentru transformarea metodei într-o intervenție terapeutică:

• Construirea genei care codifică proteina fotosensibilă dorită.
• Introducerea genei în celulele alese.
• Asigurarea activării genei, astfel încât celulele să producă proteina.
• Intervenția chirurgicală ghidată către ținta cerebrală, pentru administrare și implantare.
• Realizarea unui stimulator optic implantabil.
• Alegerea parametrilor și a protocolului clinic pentru pacient.

Selecția genetică ar putea depăși precizia unui electrod

Stimularea cerebrală profundă, abreviată DBS după denumirea engleză, folosește impulsuri electrice. La data analizei era o opțiune terapeutică stabilită pentru Parkinson, iar efectul său local putea limita reacțiile adverse asociate medicamentelor distribuite în întregul organism. Autorii precizau însă că mecanismele efectului terapeutic al DBS rămâneau insuficient înțelese.

Electrodul influențează însă celulele în mare măsură în funcție de apropierea lor de punctul de stimulare. Autorii explicau că restrângerea stimulării electrice la o singură categorie de neuroni nu era considerată fezabilă. În optogenetică, selecția poate începe înaintea iluminării, prin modificarea genetică doar a celulelor urmărite.

Rezultatul stimulării electrice depinde de poziția electrodului, intensitate, frecvență și durata impulsului. Intervalele clinice generale indicate în analiză erau de 1-4,4 volți, 60-450 de microsecunde pentru durata impulsului și 90-185 de hertzi pentru frecvență.

Un studiu de modelare citat de autori estima volume activate între 30 și 116 milimetri cubi, cu o medie de 71 de milimetri cubi. Rezultatele sugerau că stimularea unor volume mai mici din nucleul subtalamic, o structură cerebrală vizată în Parkinson, putea ameliora mai bine simptomele.

Înlocuirea curentului cu lumină nu reproduce automat același efect. Cele două metode pot activa structuri diferite. În experimente pe secțiuni de țesut cerebral, eliberarea dopaminei rămânea stabilă la stimulare electrică, dar scădea în timp la stimulare optică.

Experimentele pe rozătoare au dat rezultate diferite

În modelele animale de Parkinson evaluate de autori, intervențiile optogenetice au produs atât îmbunătățiri, cât și absența unui efect sau agravarea unui rezultat măsurat. Efectele depindeau de celulele vizate, frecvența stimulării, modelul animal și testul folosit.

Două grupuri care au investigat inhibarea neuronilor excitatori din nucleul subtalamic au obținut rezultate contradictorii. Echipa Yoon a atribuit diferența față de rezultatele echipei Gradinaru modelului animal și metodei de evaluare a ameliorării.

Chiar în cadrul cercetării Yoon din 2014, aceeași intervenție a îmbunătățit rezultatul unui test al mișcării, fără succes în alte două teste. Aceste diferențe limitau concluziile despre eficacitate, dar arătau utilitatea metodei pentru identificarea circuitelor implicate în boală.

Autorii distingeau și criteriile pe care o eventuală terapie ar trebui să le îndeplinească. Pentru Parkinson, considerau necesară demonstrarea unui avantaj față de stimularea electrică deja acceptată. Pentru epilepsia refractară, apreciau că ar putea fi relevantă și demonstrarea unei eficacități cel puțin egale cu tratamentul de comparație.

La data analizei, opțiunile principale de tratament pentru epilepsia refractară erau chirurgia cerebrală și stimularea nervului vag. Cifrele istorice citate în analiză indicau crize persistente la peste 30% dintre pacienții cu epilepsie, în pofida tratamentului medicamentos maximal. Până la 40% dintre pacienți nu erau candidați pentru îndepărtarea chirurgicală a țesutului vizat.

Un reper pentru stimularea electrică provenea din studiul privind stimularea nucleului anterior al talamusului pentru epilepsie, abreviat SANTE. Reducerea mediană a crizelor față de nivelul inițial era de 41% după un an și de 69% după cinci ani. Aceste rezultate priveau stimularea electrică, nu optogenetica.

Transferul genetic avea rezultate clinice proprii

Pentru a introduce genele în celule, cercetătorii pot folosi vectori virali, adică virusuri modificate pentru transportul materialului genetic. În construcțiile descrise, genele necesare multiplicării sunt eliminate, dar este păstrată capacitatea de a pătrunde în celule.

Autorii acordau prioritate vectorilor bazați pe virusul adeno-asociat, abreviat AAV. În datele istorice pe care le citau, aproximativ 75% dintre studiile clinice de terapie genică pentru sistemul nervos central utilizaseră această categorie, comparativ cu 6% pentru adenovirusuri, 12% pentru lentivirusuri și 6% pentru retrovirusuri.

Într-un studiu din 2007, 12 pacienți cu Parkinson avansat primiseră un vector AAV care transporta gena pentru glutamat-decarboxilază, o enzimă. Nu fuseseră observate efecte adverse atribuite terapiei genice, iar ameliorarea activității motorii durase cel puțin un an.

Un alt studiu, cu cinci pacienți, raportase un profil favorabil de siguranță, dar eficacitate redusă, pentru o intervenție genetică destinată înlocuirii dopaminei. Un studiu de fază a doua, cu 45 de pacienți, nu identificase efecte adverse grave atribuite tratamentului.

Aceste intervenții testau terapia genică și transportul genelor către creier. Rezultatele lor ofereau informații despre vectori, fără să demonstreze eficacitatea unei terapii care ar controla neuronii cu lumină.

Durata transferului genetic era un alt argument examinat. Analiza cita persistențe de cel puțin șase ani la primate, opt ani la câini și peste zece ani în creierul uman pentru vectori AAV. Aceste durate nu reprezentau măsurători ale unui beneficiu terapeutic optogenetic.

Reacția imună poate limita intervenția

Siguranța depinde atât de vehiculul genetic, cât și de proteina produsă și de cantitatea acesteia. Datele citate indicau anticorpi împotriva AAV la aproximativ 80% din populație. Aproximativ 60% aveau anticorpi neutralizanți la vârsta de zece ani, care persistau la maturitate.

Acești anticorpi pot reduce eficiența transferului genetic, inclusiv la niveluri scăzute, deși unele studii pe creier, mușchi și retină nu găsiseră o legătură între prezența lor și cantitatea de proteină produsă. Răspunsul diferă în funcție de varianta vectorului, țesut, doză și calea de administrare.

Adenovirusurile erau considerate mai puțin potrivite pentru creier din cauza reacțiilor imune și a selectivității reduse. Administrarea intravenoasă în doze mari provocase reacții severe, inclusiv fatale, în primele studii de terapie genică. Eliminarea suplimentară a genelor virale redusese reacția imună și prelungise producerea proteinei introduse.

Vectorii derivați din virusul herpes simplex, abreviat HSV, aveau avantajul capacității de a ajunge la neuroni și al transportului unei cantități mari de material genetic. Producerea proteinei introduse fusese observată până la șapte luni în creierul șobolanului, cu probleme de stabilitate. Vectorii lentivirali produceau modificări genetice permanente, pe care autorii le considerau dificil de justificat în toate aplicațiile cerebrale.

Pentru proteinele fotosensibile, nivelurile ridicate de producție puteau provoca moarte celulară, modificarea proprietăților electrice sau acumulări în neuroni. Cercetătorii dezvoltaseră modificări ale proteinelor pentru reducerea toxicității. Analiza includea și riscul ca inserarea aleatorie a materialului genetic să favorizeze apariția cancerului.

Alternativele la transportul viral investigate includeau introducerea genelor cu ajutorul impulsurilor electrice, al ultrasunetelor focalizate sau al laserului. Ultima metodă era dezvoltată în experimente de laborator pe celule, iar autorii considerau transportul viral tehnologia cea mai matură dintre cele discutate.

Lumina pierde intensitate în țesut și poate produce încălzire

Un obstacol fizic este propagarea luminii în creier. Simulările citate arătau că intensitatea putea coborî la 1% din valoarea inițială la un milimetru de punctul de emisie, prin absorbție și împrăștiere.

În experimente pe celule și secțiuni de țesut, activarea maximă a diferitelor variante ChR2 necesita o densitate de putere de 10 miliwați pe milimetru pătrat. La 1 miliwatt pe milimetru pătrat se activau aproximativ 50% dintre canale.

Autorii au examinat un scenariu cu fibră optică având miezul de 200 de micrometri și o apertură numerică de 0,22, parametru care descrie deschiderea conului de lumină. Pentru iluminarea unui volum comparabil cu o sferă de cinci milimetri diametru, estimau o putere totală de 1,5 wați pentru activare maximă, presupunând că vârful fibrei se afla în centru.

Această putere era apreciată ca prohibitivă și probabil capabilă să producă leziuni directe. Reducerea cerinței la nivelul asociat activării parțiale cobora estimarea la 150 de miliwați, valoare considerată tot ridicată și dificil de susținut într-un dispozitiv portabil.

O variantă numită ChR2-XXL avea o sensibilitate de 10.000 de ori mai mare, cu dezavantajul unui răspuns mai lent. Fibrele optice conice ofereau o altă direcție: modificarea unghiului lor permitea selectarea zonei stimulate pe verticală și putea reduce afectarea țesutului la introducere.

Implanturile aflate în cercetare foloseau fibre optice, diode luminoase miniaturale sau structuri care ghidau lumina. Unele combinau iluminarea cu înregistrarea semnalelor electrice ale neuronilor. Compatibilitatea cu imagistica prin rezonanță magnetică era, potrivit autorilor, mai ușor de obținut pentru dispozitivele optice decât pentru cele electrice.

Un implant trebuie evaluat și după răspunsul inițial

Iluminarea poate încălzi țesutul și modifica activitatea neuronilor, inclusiv a celulelor care nu au fost modificate genetic. Lumina poate avea și efecte independente de temperatură, prin mecanisme fotosensibile prezente natural. Utilizarea luminii roșii împreună cu proteine adaptate acesteia era discutată ca posibilă soluție pentru creșterea distanței dintre dispozitiv și celulele vizate.

Introducerea implantului adaugă propriile riscuri. Autorii grupau problemele care pot compromite utilizarea îndelungată în patru categorii:

• Leziuni vasculare la implantare, inclusiv hemoragii.
• Mișcări mici ale dispozitivului în raport cu țesutul.
• Afectarea locală a barierei hematoencefalice, care controlează trecerea substanțelor din sânge către creier.
• Formarea unor molecule reactive de oxigen, asociate stresului oxidativ.

Afectarea barierei poate permite pătrunderea unor proteine din sânge și poate modifica echilibrul substanțelor din jurul neuronilor. Forma implantului și traseul chirurgical pot limita o parte din leziunile inițiale, dar dimensiunile reduse ale dispozitivului trebuie împăcate cu necesarul de lumină.

În paralel, creierul își poate schimba răspunsul la stimulare. Expunerea îndelungată la impulsuri luminoase modificase în experimente comportamentul neuronilor, conexiunile și, în unele cazuri, forma celulelor. Activarea prelungită a unei variante ChR2 fusese asociată și cu moarte celulară.

Sistemele care înregistrează activitatea cerebrală și declanșează stimularea în funcție de semnalul detectat ofereau o direcție pentru epilepsie. Lumina permite stimularea concomitentă cu citirea semnalelor electrice fine, fără interferența produsă de impulsul electric de stimulare.

Autorii considerau necesară evaluarea clinică de durată pentru a stabili dacă eventualele beneficii inițiale se păstrează. Testarea accelerată a rezistenței unui dispozitiv nu poate înlocui observarea adaptării țesutului nervos și a efectelor intervenției în timp.